“瘸腿的”基因检测指标，肿瘤患者有必要做吗？
作者：闵上一篇我们介绍了TMB的定义、检测技术以及临床意义（点击阅读），尽管2020年我国颁布了《肿瘤突变负荷检测及临床应用专家共识（2020版）》（以下简称“共识”），认可了TMB对于免疫治疗的预测作用，但同时也指出了一些不足，本篇就来聊一聊当下基因检测市场上的TMB检测究竟存在哪些问题。
tTMB与bTMB的一致性
既往TMB的检测都是基于组织样本检测，随着近年来“液态活检”概念的兴起，将血液样本用于基因检测也越来越常见，根据使用样本的不同，TMB也进一步细分为使用组织样本的tTMB和使用血液样本的bTMB。两者的检测与计算方式基本一致，但由于样本本身的区别，因此即便是同一个患者的样本也会有不同结果。
2017年由Koeppel等通过WES分析了32名不同肿瘤患者组织样本及血液样本计算TMB数据，结果发现血液样本计算TMB的灵敏度仅为组织样本的53%，推断可能是因为血液中ctDNA的总量影响了检测及计算结果。
2019年的ESMO会议上发表一则简报，纳入39例不同癌种患者对比bTMB与tTMB及疗效的关系，31例患者用血液检测，21例患者用组织检测，结果bTMB中位值为5（1-53）mut/Mb，而tTMB中位值则为6（2-124）mut/Mb，其中有16例患者的血液及组织样本都检测了，发现TMB值存在一定相关性（r=0.67; p < 0.01）。然而2021年陆续有研究结果表明其对应的bTMB中位值要高于tTMB中位值，且bTMB与tTMB可能存在正相关。
另外，MYSTIC研究中提及血液检测TMB的成功率高于组织样本，导致组织样本检测失败的主要原因包括：（1）组织中肿瘤细胞/肿瘤DNA不足，占66.2%；（2）DNA提取量不足，占12.3%；（3）建库质量不合格，占21.5%。
归根结底，虽然目前的研究表明患者的bTMB与tTMB存在相关性，但bTMB的计算结果可能高于或低于tTMB，两者并不是完全相等。《共识》第三条也认可了两者的相关性，并且也提出bTMB检测目前缺乏统一标准。
你检测报告中的TMB-H可信吗？
很多病友也做过许多功课，知道无论癌种，TMB-H人群使用免疫治疗的有效率都比较高，那么问题来了，究竟多高才属于TMB-H呢？对于这种数值类的指标，我们通常会设定cut-off值（或阈值）用于划分高、中、低三档，但《共识》第七条提出“不同靶向测序Panel的TMB检测体系之间TMB阈值不能通用”（注：这里的“靶向测序Panel”即通俗所说的“大Panel”或“全基因”）。
实际上不仅仅是不同“靶向测序Panel”间的TMB阈值不能通用，即便同样使用WES检测，在不同研究中划定的阈值也有不同。
2018年Translational Lung Cancer Research上发表了一篇NSCLC中组织样本及血液样本TMB计算的综述，该综述回顾了既往临床研究中TMB检测的方式、样本及cut-off值。
结果可以看到，Keynote-001、CheckMate-026以及CheckMate-012三大研究均采用WES方式检测且均使用肿瘤组织样本。然而三个研究的cut-off值却完全不同，Keynote-001设置200 mut以上；CheckMate-026则更细致的设置100以下为低，100-242之间为中等，242以上为高；CheckMate-012则又划定高于158即为高。
WES（全外显子）作为TMB检测的金标准，在不同的临床研究中cut-off值尚有不同，不同检测公司的全基因检测Panel连包含基因数量、Panel大小以及TMB计算方式都有不同，其cut-off值更加不能通用。甚至上表中，同为Foundation Medicine公司的检测Panel——FoundationOne与FoundationOne CDx两款套餐，前者包含315个基因，后者包含324个基因，两者的TMB阈值设置也完全不同。
图片来源：摄图网
样本类型也同样会影响阈值划分，毕竟我们刚才已经说过即便同一个病人的bTMB与tTMB都不完全相同，bTMB也需要采用适合自身的阈值，如Foundation Medicine bTMB检测包含394个基因，阈值划分又与前两个套餐不同。
归根结底，TMB毕竟是人为定义的统计学概念，所谓TMB-L、TMB-M以及TMB-H也是人为划定，缺乏统一规范，不同检测Panel、不同样本、结果都不相同，与基因突变不同，后者是客观存在、有客观标准的。
目前国内市场上基因检测公司层出不穷，为了区别于其他竞争公司，每家公司的全基因套餐包含的基因数量都不同，那么必然带来TMB阈值不统一的问题，各家公司都有各自的划分标准，因此可能存在同一个病人经不同公司检测，一家判定TMB-H另一家则不是的尴尬情况，从而影响对于免疫治疗收益的预测。
另外目前多数关于TMB的研究基于欧美人群较多，缺乏中国人群数据，不便建立中国人群统一的TMB阈值，即便部分公司的检测Panel与WES金标准一致性高，也暂不推荐作为中国人群统一标准。从这一点出发，目前国内大多数的TMB-H人群划分是有些混乱的。
预测作用存在局限，TMB-H就等于免疫治疗获益吗？
2020年，FDA批准“K药”用于TMB-H（≥10 mut/Mb）的成人与儿童实体瘤患者，很多患者正是通过这条资讯认识了TMB与免疫治疗的关系（补充一点，此处TMB阈值划分是基于FoundationOne CDx，并非通用标准）。
“K药”的这项适应症是基于Keynote-158研究的亚组分析结果，有1050例不同癌种的患者是截止日期前至少26周纳入研究的，有足够的观测随访时间，其中有790例检测计算了TMB值，102例为TMB-H（≥10 mut/Mb），结果表明TMB-H组的ORR为29%，非TMB-H组的ORR仅为6%，TMB-H组的两年PFS率为22%，而非TMB-H组则为7%，由此可以看到，TMB-H组人群接受免疫治疗的有效率相对更高，获益可能性相对大一些。
除了Keynote-158以外，还有多项研究发现TMB-H人群可能从免疫治疗中获益，而我们前面已经提到过不同研究、不同检测Panel计算得到的TMB与其阈值都是不同的，这也就意味着虽然TMB-H人群可能从免疫治疗中获益，但我们却没有通用的方式可以找出这部分人群，有可能因为TMB阈值划定的不同，导致一部分潜在获益的人群被遗漏，也可能出现一部分获益较小的人群被纳入。
另外，2019年的一项回顾性分析综合了Keynote-021、Keynote-189以及Keynote-407等研究，分析了TMB对于“K药+化疗”组合的疗效预测。研究者选取了PFS及OS（数据来源Keynote-189以及Keynote-407），还有ORR（数据来源Keynote-021），并以TMB≥175 mut/exome为界限划定阈值来。
结果令人意外，无论TMB高还是低，PFS、OS以及ORR均未表现出显著差异，换句话说，TMB可能对于“K药+化疗”乃至免疫治疗联合化疗这种治疗模式的预测价值有限。
做个简单归纳，由于检测Panel的多样化，导致TMB的计算与阈值划分不统一，即便TMB-H人群可能从免疫治疗中获益，却难以真正精准区分潜在获益人群，并且随着免疫治疗联合化疗模式的普及，TMB的预测作用也在变小甚至可能无法预测。
总结
虽然TMB被当成推荐做诸多“全基因”大Panel检测的理由，也有很多的研究及文献报道表明TMB可能预测免疫治疗的效果，但深入了解后，我们可以看到关于TMB的检测从样本类型、阈值划定以及预测效果上仍存在很多需要讨论的，还未形成统一通用规范。
1、组织样本与血液样本检测得到的结果之间不能直接换算组织样本及血液样本均可用于TMB的检测，需采用NGS技术做大Panel，两种样本之间存在一定相关性且均可用于预测免疫治疗的效果，但需要注意的是组织样本得到的tTMB与血液样本检测得到的bTMB之间并不能直接换算。
这意味着，我们在实际治疗中，可以用血做“全基因”计算TMB，但需要注意并不能简单的以组织样本的标准来衡量bTMB的高低，这里较为考验检测所自身的水平。
2、TMB值受基因检测公司自身算法影响较大衡量TMB高低需要划定阈值，然而不仅是不同样本检测后的阈值不同，检测Panel内包含的基因数量不同也需要划定不同的阈值，且目前各Panel划定的阈值间并不相同。
这就是说各位即便在市场上各家公司的“全基因”检测得到TMB值，其高低划分也只代表该公司自身算法下的高低，并不能直接套用现有研究中的划分标准，那么自然也不能直接套用现有研究结论去指导免疫治疗获益情况。
3、TMB值预测免疫治疗联合化疗方案作用不明显多个研究的结论证明了TMB可用于预测免疫治疗的获益，但仅限于单独使用免疫治疗的情况，当采用免疫治疗联合化疗的方案时，TMB的预测作用则并不显著。由于真实治疗中免疫治疗的有效率比较尴尬，目前很多病友在选择治疗方案时都会直接考虑免疫治疗联合化疗，也让TMB对于这部分病友的价值下降很多。
综上所述，TMB虽然作为免疫治疗的生物标志物已经得到专家及指南的认可，但在实际使用中仍面临诸多潜在问题，缺乏统一的规范使得实际中各检测公司TMB的参考价值下降，加之做TMB检测需选择“全基因”大Panel价格不菲，各位在选择时可根据自身情况考虑，不必强求。
参考文献.Koeppel, Florence, et al. "Whole exome sequencing for determination of tumor mutation load in liquid biopsy from advanced cancer patients." PloS one 12.11 (2017): e0188174..Araujo, D. V., et al. "Blood-based TMB (bTMB) correlates with tissue-based TMB (tTMB) in a multi-cancer phase I IO cohort." Annals of Oncology 30 (2019): v512..Park, Jewel, et al. "Exploring real-world concordance of tissue mutation burden (TMB) from blood and tissue in patients with solid tumors." medRxiv (2021): 2021-05.
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